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免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）是研究蛋白质相互作用的常用方法，其基本原理是利用固定在磁珠或琼脂糖珠上的“抗体”对“目标蛋白”进行捕获，并进一步捕获与目标蛋白有相互作用的蛋白免疫沉淀。本文将详细介绍内源性蛋白Co-IP实验步骤，并指导如何解读结果。
实验原理
样本裂解后，孵育诱饵蛋白抗体，抗体捕获样本中的诱饵蛋白，再与protein A/G beads孵育，将“抗体-诱饵蛋白-互作蛋白”一起“共沉淀”到Beads上免疫沉淀。洗掉未结合的蛋白后，再将“诱饵蛋白-互作蛋白”从Beads上洗脱下来，得到Co-IP洗脱液，该洗脱液既可用于Western Blot检测（验证已知结合蛋白），也可用于质谱鉴定（筛选未知结合蛋白）。
图1 内源性蛋白Co-IP实验原理图
实验步骤
实验大致流程：总蛋白提取→Input样品制备→总蛋白与抗体孵育→proteinA/G磁珠与抗体结合→蛋白洗脱→WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白免疫沉淀。
1 总蛋白提取
1.1 动物细胞
（1）培养目标细胞免疫沉淀，待细胞生长至合适密度，收集细胞；
（2）用预冷PBS缓冲液清洗细胞2-3次免疫沉淀，加入300-500 μL预冷的IP裂解缓冲液，在IP裂解液中预先加入3-5 μL蛋白酶抑制剂，现用现配；
（3）4℃混匀仪上裂解30 min；
（4）为了更充分裂解免疫沉淀，最好冰上超声至溶液基本澄清；如果无超声条件，可置于冰上裂解30 min，期间每10 min涡旋混匀一次，每次5 s；
（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min免疫沉淀，收集上清至新的1.5 mL EP管中；
1.2 动物组织
（1）采用预冷的PBS清洗新鲜组织免疫沉淀，去除血液等成分；
（2）实验组和对照组分别取0.1-0.2 g干净的组织免疫沉淀，用液氮在研钵中充分研磨，随后转移至预冷的新离心管中；
（3）每组加入300-500 μL预冷的IP裂解缓冲液、3-5 μL蛋白酶抑制剂免疫沉淀，吹打混匀；
（4）冰上超声破碎至溶液基本澄清；
（5）4℃离心机12000 rpm离心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中免疫沉淀。
2 Input样品制备
（1）所提蛋白每组各取30 μL免疫沉淀，加入1×SDS-PAGE上样缓冲液充分混匀，95℃加热5-10 min；
（2）通过Western Blot实验验证样本中目标蛋白的表达情况免疫沉淀。
3 总蛋白与抗体孵育
（1）将余下蛋白样本平分为IP实验组、IP对照组免疫沉淀，实验组加入目标蛋白的IP级别抗体，对照组加入Normal IgG抗体（与实验组抗体同源同型）；
（2）4℃孵育4 h或过夜免疫沉淀。
图2 内源性蛋白Co-IP实验分组流程图
4 proteinA/G磁珠与抗体结合
（1）磁珠预处理：每组取25 μL proteinA/G磁珠加入200 μL漂洗缓冲液免疫沉淀，颠倒混匀30次；
（2）放磁力架上静置1 min免疫沉淀，弃上清；
（3）重复上述洗涤步骤1次；
（4）向磁珠中加入蛋白样本/抗体复合物免疫沉淀，充分混匀，置于4℃混匀仪上孵育2 h；
（5）放磁力架上静置1 min免疫沉淀，弃上清，加入500 μL漂洗缓冲液，颠倒混匀30次；
（6）放磁力架上静置1 min，弃上清，重复上述洗涤步骤2次免疫沉淀。
5 蛋白洗脱
5.1变性洗脱
（1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱免疫沉淀，振荡混匀后瞬离，95℃加热5-10 min；
（2）放磁力架静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，进行SDS-PAGE或Western Blot检测，如果需要进行质谱检测，则切胶条后送检免疫沉淀。
5.2非变性洗脱
（1）向磁珠中加入40-50 µL洗脱缓冲液免疫沉淀，涡旋振荡20 s，放混匀仪上室温洗脱10-15 min，涡旋振荡20 s；
（2）1000 g离心20 s免疫沉淀，放磁力架上静置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；
（3）洗脱后的蛋白-80℃保存，或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和质谱等实验免疫沉淀。
6 WB检测是否存在靶蛋白/质谱鉴定洗脱液中的蛋白
6.1 WB检测是否存在靶蛋白
通过蛋白印迹(Western Blot)技术分别使用Anti-Bait和Anti-Prey对沉淀中的蛋白质进行检测，若能够检测在沉淀中同时存在诱饵蛋白和猎物蛋白，则说明这两种蛋白之间存在相互作用免疫沉淀。
6.2 质谱鉴定洗脱液中的蛋白
通过质谱（LC-MS/MS）技术对IP洗脱液中的蛋白成分进行鉴定和分析，筛选诱饵蛋白的未知互作蛋白免疫沉淀。
实验注意事项
1.保证加入蛋白酶抑制剂免疫沉淀，实验需在冰上操作，避免蛋白出现降解；
2.选择合适的IP级别抗体免疫沉淀，最好是单抗；
3.使用合适的洗脱液免疫沉淀，保证洗脱液的强度和PH值合适；
4.清洗次数会影响最终结果免疫沉淀，清洗次数过多会导致弱结合蛋白被洗脱，检测信号弱；清洗次数过低会导致非特异性结合未被清洗干净，信噪比高；
5.抗体和beads为非共价结合，会一同被洗脱，产生“抗体轻重链”污染免疫沉淀。
实验结果
Input组：利用Anti-Bait、Anti-Prey对样本裂解液进行WB检测免疫沉淀，验证Input中是否存在Bait、Prey，从而确定蛋白的表达情况以及抗体效果；
IgG组(阴性对照组)：排除非特异性结合的干扰免疫沉淀，normal IgG不能富集Bait，一般不会有Bait条带，如果有条带说明Bait与beads或IgG有非特异性结合，需要重新完善下方法；
IP组(实验组)：Anti-Bait可以特异性富集Bait，所以一定会有Bait条带，没有条带说明IP实验失败，需要复核IP流程，或检查Anti-Bait是否可以用于IP实验；如果IP洗脱液中也能检测到Prey，说明Bait和Prey存在相互作用免疫沉淀。
图3 内源性蛋白Co-IP实验结果解析图
内源性Co-IP实验验证两个已知蛋白（Bait和Prey）是否存在相互作用，如果最终的结果均有条带，则可以证明两个蛋白之间存在相互关系，上图为IP阳性结果示意图：表明Bait可以与Prey结合，存在相互作用免疫沉淀。